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大鼠移植肝保护管理论文

2020-03-16发布者:青青草大小:98.10 KB 下载:0

【摘要】目的探讨川芎嗪(TMP)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照对大鼠移植肝的保护作用。方法参照 Delriviere 和 Kamada 等方法建立大鼠肝移植模型,将大鼠随机分为 3 组:A 组(假手术组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照、B 组 (肝移植对照组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照和 C 组(TMP 干预组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。采用全自动生化分析仪检测术后血清肝功能 (ASTAST、ALT、LDH))水平;应用免疫组化 SP 法结合病理图像分析仪测定肝组织中 Bcl2、Bax 的表达情况;H)E 染色观察其病理形态学变化。结果(1)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照C 组 AST、ALT、LDH) 明显低于 B 组(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。(2)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照C 组 Bcl-2 或 Bcl-2/Bax 表达明显高于 B 组(P<0.05)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照, 而 Bax 表达无明显变化(P>0.05)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。(3)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照A 组无明显病理形态改变,B 组术后肝组织出 现明显的病理损害,C 组病理变化明显减轻。结论 TMP 可能通过上调 Bcl-2 或 Bcl-2/Bax 表达而减轻肝移植体的低温保存再灌注损伤,对供肝有保护作用。 【关键词】肝移植;保存再灌注损伤;川芎嗪;Bcl-2;Bax Protectiveeffectoftetramethylpyrazineonlivergraftinratlivertransplantation 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectoftetramethylpyrazine(ASTTMP)pr econditioningonlivergraftinratlivertransplantation.MethodsPerformingtheoperationoflivertr ansplantationinmaleSpragueDawleyratsreferredtoDelriviereandKamadawithcuffanastomosingmethods,theratswerera ndomlydividedintothreegroups: Agroup(ASTn=6,shamoperationgroup),Bgroup(ASTn=30×2,livertransplantationcontrolgroup) ,Cgroup(ASTn=30×2,TMPgroup).Theparametersofliverfunction(ASTAST,ALTandLDH))werete stedbyautobiochemicalanalyseringroupBandCafterreperfusion0.5h,3h,6h,24h,48hrespectively viatheplasmasamples;partofthelivertissuewassampledtodeterminetheexpressionofBcl2andBax.TheparametersingroupAwereexamed3haftertheoperation.TheexpressionofBcl2andBaxwasdeterminedbyimmunohistochemistytechniquewithpathologicalimaginganalys er.Also,partsoflivertissuesampleswereusedtodetectthehistopathologicchanges.Results (1)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照ThelevelsofAST,ALTandLDH)weresignificantlydecreasedingroupCcomparedwithth atingroupB(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照afterreperfusion0.5h,3h,6h,24h,48hrespectively. (2)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照TheexpressionofBcl2weresignificantlyincreasedingroupCcomparedwiththatingroupB(P< 0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照afterreperfusion0.5h,3h,6hrespectively.ThedifferentexpressionofBaxbetweengr oupCandgroupBwasnonsignificant. (3)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照ApproximatelynormallymorphologicstructurewasfoundingroupA,someobvioushisto pathologicchangesingroupBcouldbeseenmorphologically.ButingroupC,somehistopathol ogicchangeswerealleviated.ConclusionTMPcanimproveliverfunctionandalleviatehistopath ologicdamageinlivertransplantationinratsduringpreservationandreperfusioninjuryprobably byup-regulatingtheexpressionofBcl-2orBcl-2/Baxandexertaprotectiveeffectonlivergraft. 【Keywords】livertransplantation;preservationandreperfusioninjury; tetramethylpyrazine;Bcl-2;Bax 肝移植是治疗终末期肝病最有效的手段,肝移植体低温保存再灌注损伤是肝移植术后 肝原发性无功能(PFN)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照的重要原因,与细胞凋亡密切相关。目前人们针对凋亡发生的各 个环节,探索各种防治方法,从而减轻肝移植体保存再灌注损伤成为了研究的热点。川芎 嗪(tetramethylpyrazine,TMP,四甲基吡嗪)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照是从中药川芎中分离、纯化的一种生物碱, TMP 具有抑制血小板的聚集、改善微循环、保护血管内皮细胞、对抗氧自由基的氧化作用 以及钙拮抗作用;TMP 作为钙拮抗剂,可能通过激活腺苷酸环化酶及抑制钙离子内流作用 而抑制细胞凋亡[1];TMP 还可以影响 c-fos 表达而抑制细胞凋亡[2]。但目前 TMP 在 细胞内的分子机制研究甚少,需进一步研究。TMP 是否影响移植肝保存再灌注损伤细胞凋 亡调控基因的表达,尚未见报道。本实验通过建立大鼠肝移植模型,观察 TMP 对保存再灌 注损伤中肝组织 Bcl-2、Bax 表达的影响,探讨 TMP 对大鼠移植肝的保护作用。 1 材料与方法 1.1 材料封闭群雄性 SD 大鼠 126 只,供体体重 200~250g,受体体重 340~380g, 实验动物购于中南大学实验动物中心。SSW-3X 显微外科手术器械包(上海医疗器械有限 公司)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。Q550CW 自动病理图像分析仪(德国 LEICA 公司)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。TMP(40mg/2ml/支,北京 第四制药厂)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。Bcl-2、Bax 免疫组化试剂盒、AST、ALT、LDH) 试剂盒(北京中山生物技 术有限公司)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。 1.2 实验分组及处理封闭群 SD 大鼠(n=126)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照随机分为 3 个组:A 组(n=6,假手术 组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照、B 组(n=30×2,肝移植对照组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照、C 组(n=30×2,TMP 干预组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;B、C 组再根据 再灌注后 0.5h、3h、6h、24h、48h 不同时相,又分为 5 个亚组。 1.3 制备大鼠肝移植模型参照 Delriviere 和 Kamada 等[3]方法建立大鼠肝移植模型。 安体醚吸入麻醉,供体肝上上腔静脉结扎,供体肝下上腔静脉与受体右肾静脉按照 Delriviere 等[4]方法行袖套吻合(套管内径为 2.0~2.2mm、外径为 2.8~3.0mm)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;供肝 门静脉与受体门静脉行袖套吻合(套管内径为 1.5~1.8mm、外径为 2.0~2.2mm)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;结扎受 体肝固有动脉;最后将供肝胆管与受体胆管采用套管法重建(内径为 0.65mm、外径 0.96mm 硬膜外导管)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。B 组:灌洗及保存液为 4℃冷平衡盐溶液(含肝素钠 5u/ml)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;C 组:灌洗及保存液为冷平衡盐溶液中加 TMP(320g/L)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;A 组:开腹后游离肝周韧带,分 离胆总管及门静脉,关腹。 1.4 标本的采集和检测 B、C 组观察术后的一般情况,并分别于肝移植再灌注后 0.5h、3h、6h、24h、48h 取腹主动脉血待测肝功能(AST、ALT、LDH))对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,同时取移植肝 一小块肝组织待制石蜡标本;A 组于关腹后 3h 取标本作为正常对照。采用全自动生化分析 仪进行肝功能测定;利用免疫组织化学染色的方法结合病理图像分析测定各切片中细胞凋 亡调控基因 Bcl-2、Bax 表达情况。取部分切片进行常规 H)E 染色,光镜下观察肝组织的病 理形态学变化。 1.5 免疫组化染色方法石蜡切片常规脱蜡至水;3%过氧化氢阻断内源性过氧化酶活性; 微波修复抗原,加封闭用羊血清,37℃孵育 15min;加 1∶50Bcl-250Bcl-2 或 1∶50Bcl-250Bax 抗体工作液, 4℃孵育过夜;滴加生物素的羊抗兔 IgM(1∶50Bcl-2100)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,37℃孵育 30min;每张切片滴加 50μlSPlSP 复合物,于 37℃孵育 30min;以新鲜配制的 DAB 显色,苏木素复染,封片,显微 镜下观察。镜下可见阳性染色主要位于胞浆内,少数为核膜,呈浅黄、棕黄或棕褐色颗粒。 每张切片内中外随机选取 6 个视野,运用病理图像分析仪显微镜下观察并测定阳性细胞的 辉度值(与 Bcl-2、Bax 表达成反比)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。 1.6 统计学方法所有计量资料数据以均数±标准差(x±s)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照表示,在计算机上用 SPSS11.0 软件包处理,方差齐性分析后,组间比较用均数 t 检验,组内比较用单因素方差 分析,组内不同时点间两两比较采用 q 检验,指标间相关分析用直线相关分析,P<0.05 为差异有显著性。 2 结果 2.1 一般情况本实验肝移植 60 例,供体手术时间、血管袖套准备时间、受体手术时间、 无肝期分别为(29.65±3.18)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照min、(9.05±2.12)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照min、(42.64±4.07)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照min、 (5.18±1.23)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照min。手术成功率为 88.33%(53/60)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。本实验发现,肝移植 TMP 干预组 较肝移植对照组在供肝恢复血流后,其表面很快呈鲜红色,无花斑状表现,门静脉不扩张, 肝脏无肿胀,肠管无淤血,肠系膜动脉搏动有力,胆汁源源不断流出,上述表现明显优于 肝移植对照组。 2.2 肝组织形态学变化假手术组(A 组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照无明显形态学改变;肝移植对照组(B 组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照术 后肝组织随着再灌注时间的延长,病理变化逐渐加重:肝细胞排列紊乱,细胞浊肿,变性 呈颗粒状,肝窦变窄,中性粒细胞附壁,继而出现细胞核染色加深及部分核浓缩,部分还 出现点状或小片状坏死,以术后 6h 最严重,6h 后,病理变化随着再灌注时间的延长逐渐 减轻;肝移植 TMP 干预组(C 组)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照病理变化较 B 组相应时点明显减轻:轻度的组织水肿, 肝窦内皮渗出较少,小叶结构基本完好,炎症细胞浸润较少(见图 1~2)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。 2.3 大鼠各组 AST、ALT、LDH) 含量与 A 组比较,B、C 组各时点 AST、ALT、LDH) 含量均显著性增加(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;与 B 组相应的时点比较,C 组各时点 AST、ALT、LDH) 含量显著性降低(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;B、C 组内各时点间 AST、ALT、LDH) 含量单因素方差分析 差异显著(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,且每两个时点间 q 检验有显著性时效关系(P<0.05)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,见表 1。 注:A 组 AST、ALT、LDH) 含量分别为(82.78±5.60)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照u/L、(48.80±4.30)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照u/L、 (AST564.83±30.66)u/L;与 A 组比较,△P<0.01;与 B 组比较,#PP<0.01 2.4 各组 Bcl-2、Bax 表达辉度值变化与 A 组比较,B、C 组于肝移植缺血再灌注后 0.5h、3h、6hBcl-2 表达显著性增加(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,Bax 表达显著性降低(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;与 B 组比较,C 组 0.5h、3h、6hBcl-2 表达显著性上调(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,Bax 表达差异无显著性; 并且 B、C 组内各时点 Bcl-2、Bax 表达差异有非常显著性(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,且每两个时点间 q 检验有显著性时效关系(24h 与 48h 间例外)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照(见表 2、图 3~6)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。 注:A 组 Bcl-2、Bax 阴性对照值均为(153.09±1.61)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照/μlSPm2;△与 A 组各时点 Bcl-2 值比较,P<0.01,Bax 值 P<0.01;#P与 B 组各时点 Bcl-2 值比较,P<0.01,Bax 值 P> 0.05 2.5 肝功能(AST、ALT、LDH))对大鼠移植肝的保护作用。方法参照水平与 Bcl-2、Bax 表达的相关性 AST、ALT、LDH) 水平与 Bcl-2 的表达呈显著性负相关,r 值分别为-0.39(P<0.05)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照、-0.51(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照、0.52(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照;AST、ALT、LDH) 水平与 Bax 的表达呈显著性正相关,r 值分别为 0.71、0.54、0.75,P<0.01;AST、ALT、LDH) 水平与 Bcl-2/Bax 表达呈显著性负相关,r 值分别为-0.73、-0.72、-0.86,P<0.01。 3 讨论 肝移植术后肝原发性无功能是肝移植后死亡的主要原因,与肝移植低温保存再灌注损 伤密切相关[5],其中细胞凋亡在组织细胞的丢失和器官功能衰竭方面发挥着重要作用 [6,7]。肝移植体从可逆到不可逆的转变反映了肝细胞的增殖、分化和细胞凋亡的精细 平衡,基因调控是细胞凋亡的重要调控机制[8]。 Bcl-2 基因家族是最受关注的基因之一,任何一个死亡启动子与 Bcl-2 或 Bcl-XL 形成异 型二聚体时,细胞就可以避免发生凋亡[9]。Bcl-2 蛋白是一种膜整合蛋白,主要分布在 线粒体内膜细胞膜内表面、内质网、核膜等处,具有抑制凋亡的作用[10]。目前认为其 抗凋亡的主要机制是:抑制细胞内织网钙库释放钙,维持细胞内钙的稳定;恢复线粒体膜 电位和调制线粒体内外膜之间通透性转变孔(PTP)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,抑制线粒体释放促凋亡蛋白质如细 胞色素 C、凋亡蛋白激活因子(APAF-1)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照、凋亡诱导因子(AIF)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照等[11,12];抑制 Caspase 如 Caspase-9 的激活,从而抑制细胞凋亡级联放大反应[13,14];直接抗氧 化,对抗氧化应激所致的细胞凋亡[15];抑制凋亡蛋白 Bax 及 Bak 的细胞毒作用等。本 实验结果显示移植肝对照组再灌注 0.5h 即出现 Bcl-2 表达增加,与假手术组比较差异有非 常显著性(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,随再灌注时间延长,Bcl-2 表达进行性降低,肝功能形态损害进行 性加重,再灌注后 6h 最明显,提示移植肝在保存再灌注损伤中可能通过增加 Bcl-2 表达而 抑制凋亡,但其作用是有限的,随着再灌注时间延长,其抑制作用逐渐减弱。TPP 干预组 Bcl-2 表达比肝移植对照组显著性上调(P<0.01)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,肝功能形态损害明显减轻,提示 TMP 可能上调 Bcl-2 表达,进一步抑制凋亡而保护移植肝。 Bax 为 Bcl-2 家族中的一员,与 Bcl-2 不同的是,Bax 是促进凋亡。其机制可能是通过 诱导 Caspase 的释放来实现的,而 Caspase 能激活来自线粒体的细胞色素 C,因而可能 对抗 Bcl-2 的抑制细胞凋亡作用[16,17];Bax 的过度表达还可以促进细胞因子缺乏介 导的细胞凋亡。本实验发现 Bax 的表达在肝移植后,随着再灌注时间延长逐渐增加,以再 灌注 6h 最明显,后又进行性下降,24h 后基本恢复正常(与假手术组比较)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照,提示移植肝 保存再灌注期间可能激发 Bax 表达而促进细胞凋亡,TMP 干预对 Bax 表达无明显影响。 综上所述,川芎嗪可以通过上调 Bcl-2 或 Bcl-2/Bax 表达而有效地减轻肝移植体的低温 保存再灌注损伤,对供肝有保护作用。但其上调 Bcl-2 或 Bcl-2/Bax 表达的具体机制尚有待 进一步研究。 【摘要】目的总结成人主动脉瓣人工机械瓣膜置换手术的经验。方法 1996 年 1 月~ 2005 年 1 月对 1 9例成人小主动脉瓣环患者行人工主动脉瓣置换。其中 13 例行瓣膜侧倾 缝合置换主动脉瓣膜;6 例进行主动脉瓣瓣环加宽。结果治愈 17 例(AST89.47%),死亡 2 例 (AST10.53%)。结论对主动脉瓣疾病行人工机械瓣瓣膜置换手术术前充分估计瓣环大小,术中 良好的灌注、心肌保护、选择合适瓣膜和恰当手术方法,可降低死亡率。 【关键词】主动脉瓣;人工机械瓣;瓣膜置换 Clinicalanalysisofvalvularreplacementinadultswithstenoticaorticannulus 【Abstract】ObjectiveTheaimofthisstudyistosumuptheexperienceofartificialmechanic alaorticvalvereplacementinadults.MethodsFromJan1996toJan2005,19patientsaorticvalv ereplacementforaorticstenosisinpatientswithsmallaorticroot,13mechanicalprostheticvalv eswereimplantedatanangleofinclinationandaorticrootenlargementprocedureshadbeenperf ormedin6patients.Results17patientsdischargedfromthehospitalingoodconditionafteroperat ionsand2patientsdied.Themortalityis10.53%.ConclusionWithregardtomechanicalprostheti caorticvalvereplacement,evaluatingthediametersofaorticannulusfullybeforeoperation,s ufficientmyocardialperfusionandprotectionduringoperation,andchoosingappropriatetypev alveandoperativeprocedurecouldreducethemortality. 【Keywords】aorticvalve;artificialmechanicalvalve;valvularreplacement 提高成人主动脉瓣人工机械瓣膜置换手术的成功率,降低病死率,是心脏外科发展的 必然趋势。我们对 19 例成人小主动脉瓣环人工瓣膜置换术进行了分析和探讨,现报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料我院 1996 年 1 月~2005 年 1 月行主动脉瓣膜置换手术 156 例,其中细 小主动脉瓣环(术中主动脉瓣环直径<21mm)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照19 例,占总数 12.18%,19 例均为女姓; 年龄 45~68 岁。单纯主动脉瓣病变 3 例,其余均为联合瓣膜病。术前有活动后心悸气短 11 例,晕厥或心绞痛病史 1 例,有左、右心功能不全者 2 例。主动脉瓣听诊区可闻及杂音 14 例。 1.2 方法全组均行超声检查,阳性率达 100%,术前疑诊主动脉瓣二叶瓣 3 例,左室舒 张末直径 37~61mm,心电图、心脏 X 线片检查提示左室增大 10 例。诊断明确后均行手 术治疗,手术在复合麻醉,中度低温、中度血液稀释、体外循环心脏停跳下手术,我院使 用晶体冷停跳液灌注,阻断升主动脉钳后常规先由主动脉根部顺行灌注心肌保护液,若术 前诊断主动脉瓣膜关闭不全或灌注效果不佳,改为切开主动脉根部左右冠状动脉直接灌注, 心肌安静,心肌局部置冰屑水。主动脉前壁切开显露主动脉瓣膜,切除主动脉瓣膜行人工 机械瓣膜置换手术。其中置换双叶机械瓣 11 例,单叶机械瓣 8 例。主动脉瓣狭窄 11 例, 主动脉瓣关闭不全 3 例,主动脉瓣狭窄合并关闭不全 5 例。本组病例中,13 例主动脉瓣环 <21mm,>19mm,行瓣膜侧倾缝合主动脉瓣膜,无冠瓣侧缝合在瓣上的主动脉壁上;6 例进行瓣环加宽,术中测主动脉瓣环均<21 mm,其中 3 例 19 mm测瓣器不能通过。应用 Nicks法加宽主动脉瓣环。法加宽主动脉瓣环。19 例病人均置换机械瓣:19~21 mmSt.Jude瓣瓣(AST包 括HPStHPSt.Jude瓣瓣),21 mmCarboMe瓣dics法加宽主动脉瓣环。瓣,21mm 国产机械瓣膜。术 中证实主动脉二叶瓣膜 3 例,合并手术有二尖瓣置换 16 例。 2 结果 本组 19 例,治愈 17 例(89.47%)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。术中术后发生各种并发症 4 例,其中 2 例发生主 动脉根部出血,2 例发生低心排出量综合征,发生其他并发病 3 例。因为主动脉根部出血 1 例,低心排出量 1 例,早期死亡 2 例(10.53%)对大鼠移植肝的保护作用。方法参照。 3 讨论 3.1 主动脉瓣瓣环大小的估计本组病例中病人均行心脏超声检查,术前心脏超声检查 是诊断主动脉瓣膜疾病的重要手段。尤其是判断主动脉根部宽度是手术前预测人工瓣膜大 小的重要依据。但应注意:术前超声检查,若经验不足往往将扩张的主动脉窦部作为主动 脉瓣环来测量,不能明确瓣环是否需要加宽,夸大了瓣环,致手术中准备不足,应以术中 测量为准。6 例主动脉瓣环加宽病人术前超声均提示主动脉瓣环狭窄。6 例主动脉瓣环加宽 均为女性,身高>155mm,体重 55kg 以上,术前患者超声提示主动脉根部直径均值为 20.3mm。因此,女性患者主动脉瓣膜置换,术前要有扩大瓣环的准备。 3.2 手术中放置瓣膜困难时的处理主动脉瓣环加宽:主动脉瓣环狭小的主动脉瓣置换 术,术中探查主动脉瓣环直径,不能直接缝合置换的,要加宽主动脉根部[1~3],一般 认为,术前主动脉瓣环 19 mm以下病人应作为瓣环扩大的适应证。若人工瓣膜过小,术后 跨瓣压差过大,会导致左心室肥厚劳损,引起心律失常等,再手术率和病死率较高 [1,2,4]。针对小主动脉瓣环的主动脉根部拓宽术临床常用Nicks法加宽主动脉瓣环。、Konno、 Manouguian等方法。本组有 6 例瓣环加宽,均以Nicks法加宽主动脉瓣环。法加宽主动脉根部, 在加宽主动脉瓣环中此手术方法简单、心肌阻断时间短,更有利于患者术后恢复。Kon no法可扩大主动脉根部约 2 倍,但术中有可能伤及传导束,手术复杂,心肌阻断时间长,
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